Producten
Lifecosm SARS-Cov-2-RT-PCR-detectiekit voor 2019-nCoV
Verwacht gebruik
Deze kit wordt gebruikt voor de kwalitatieve detectie van het nieuwe coronavirus (2019-nCoV) met behulp van keeluitstrijkjes, nasofaryngeale uitstrijkjes, bronchoalveolaire lavagevloeistof, sputum. Het detectieresultaat van dit product is alleen voor klinische referentie en mag niet als enige worden gebruikt bewijs voor klinische diagnose en behandeling. Een uitgebreide analyse van de aandoening wordt aanbevolen in combinatie met de klinische manifestaties van de patiënt en andere laboratoriumtests.
Inspectie principe
De kit is gebaseerd op one-step RT-PCR-technologie.In feite werden de ORF1ab- en N-genen van het nieuwe coronavirus 2019 (2019-nCoV) geselecteerd als doelgebieden voor amplificatie.Specifieke primers en fluorescerende probes (N-gen-probes zijn gelabeld met FAM en ORF1ab-probes zijn gelabeld met HEX) zijn ontworpen om 2019 nieuw type coronavirus-RNA in monsters te detecteren.De kit bevat ook een detectiesysteem voor endogene interne controle (genprobe voor interne controle gelabeld met CY5) om het proces van monsterverzameling, RNA- en PCR-amplificatie te bewaken, waardoor vals-negatieve resultaten worden verminderd.
Hoofd onderdelen
| Componenten | Volume（48T/Kit） |
| RT-PCR-reactieoplossing | 96 µl |
| nCOV-primer TaqMan-sondemengsel (ORF1ab, N-gen, RnaseP-gen) | 864 µl |
| Negatieve controle | 1500 µl |
| nCOV positieve controle (l ORF1ab N-gen) | 1500 µl |
Eigen reagentia: RNA-extractie of zuiveringsreagentia.Negatieve/positieve controle: De positieve controle is RNA dat het doelfragment bevat, terwijl de negatieve controle nucleïnezuurvrij water is.Tijdens gebruik moeten ze deelnemen aan de extractie en moeten ze als besmettelijk worden beschouwd.Ze moeten worden behandeld en verwijderd in overeenstemming met de relevante voorschriften.
Het interne referentiegen is het menselijke RnaseP-gen.
Bewaarcondities en vervaldatum
-20 ± 5 ℃, vermijd herhaaldelijk invriezen en ontdooien meer dan 5 keer, geldig voor 6 maanden.
Toepasselijk instrument
Met FAM / HEX / CY5 en ander meerkanaals fluorescerend PCR-instrument.
Voorbeeldvereisten
1.Toepasselijke soorten monsters: keeluitstrijkjes, nasofaryngeale uitstrijkjes, bronchoalveolaire lavagevloeistof, sputum.
2. Specimenverzameling (aseptische techniek）
Faryngaal uitstrijkje: Veeg de amandelen en de achterwand van de keelholte af met twee wattenstaafjes tegelijk en dompel vervolgens de kop van het wattenstaafje onder in een reageerbuis met de monsteroplossing
Sputum: Nadat de patiënt een diepe hoest heeft gehad, verzamelt u het opgehoeste sputum in een reageerbuis met schroefdop die de monsteroplossing bevat;bronchoalveolaire lavagevloeistof: bemonstering door medische professionals.3. Opslag en transport van monsters
Specimens voor virusisolatie en RNA-testen moeten zo snel mogelijk worden getest.Specimens die binnen 24 uur kunnen worden gedetecteerd, kunnen worden bewaard bij 4 ℃;die niet binnen 24 kunnen worden gedetecteerd
uren moeten worden bewaard bij -70 ℃ of lager (als er geen opslagconditie van -70 ℃ is, moeten ze worden bewaard
tijdelijk bewaard bij -20℃koelkast).Specimens moeten tijdens transport herhaaldelijk invriezen en ontdooien voorkomen.Monsters moeten zo snel mogelijk na afname naar het laboratorium worden gestuurd.Als monsters over lange afstanden moeten worden vervoerd, wordt droogijsopslag aanbevolen.
Testmethoden
1 Monsterverwerking en RNA-extractie (monsterverwerkingsgebied)
Het wordt aanbevolen om 200 μl vloeistofmonster te nemen voor RNA-extractie.Raadpleeg voor gerelateerde extractiestappen de instructies van commerciële RNA-extractiekits.Zowel het negatieve als het negatieve
controles in deze kit waren betrokken bij de extractie.
2 PCR-reagensbereiding (gebied voor reagensbereiding)
2.1 Haal alle componenten uit de kit en ontdooi en meng bij kamertemperatuur.Centrifugeer voor gebruik enkele seconden bij 8.000 tpm;bereken de vereiste hoeveelheid reagentia en het reactiesysteem wordt voorbereid zoals weergegeven in de volgende tabel:
| Componenten | N portie (25µl systeem) |
| nCOV primer TaqMan sondemengsel | 18 µl × N |
| RT-PCR-reactieoplossing | 2 µl × N |
| *N = aantal geteste monsters + 1 (negatieve controle) + 1 (nCOVpositieve controle) | |
2.2 Nadat u de componenten grondig hebt gemengd, centrifugeert u gedurende een korte tijd om alle vloeistof op de buiswand naar de bodem van de buis te laten vallen en verdeelt u vervolgens het 20 µl amplificatiesysteem in de PCR-buis.
3 Bemonstering (monstervoorbereidingsgebied)
Voeg na extractie 5μl van de negatieve en positieve controles toe.Het RNA van het te testen monster wordt toegevoegd aan de PCR-reactiebuis.
Sluit het buisje stevig af en centrifugeer een paar seconden bij 8.000 tpm voordat u het naar het amplificatiedetectiegebied brengt.
4 PCR-versterking (versterkt detectiegebied)
4.1 Plaats de reageerbuis in de monstercel van het instrument en stel de parameters als volgt in:
| fase | Fiets nummer | Temperatuur(°C) | Tijd | verzamelingplaats |
| Achteruittranscriptie | 1 | 42 | 10 minuten | - |
| Pre-denaturatien | 1 | 95 | 1 minuut | - |
| Fiets | 45 | 95 | 15s | - |
| 60 | jaren '30 | gegevensverzameling |
Kanaalselectie instrumentdetectie: Selecteer het FAM、HEX、CY5-kanaal voor het fluorescentiesignaal.Voor referentie fluorescerend GEEN, kies alstublieft niet ROX.
5 resultaatanalyse (raadpleeg de experimentele instructies van elk instrument voor instelling)
Sla na de reactie de resultaten op.Pas na analyse de startwaarde, eindwaarde en drempelwaarde van de basislijn aan volgens de afbeelding (de gebruiker kan deze aanpassen aan de werkelijke situatie, de startwaarde kan worden ingesteld op 3~15, de eindwaarde kan worden ingesteld op 5~20, aanpassing) in de logaritmische grafiek Bij de drempel van het venster bevindt de drempellijn zich in de logaritmische fase en is de versterkingscurve van de negatieve controle een rechte lijn of onder de drempellijn).
6 Kwaliteitscontrole (Een procedurele controle is inbegrepen in de test) Negatieve controle: geen duidelijke versterkingscurve voor FAM-, HEX-, CY5-detectiekanalenn
COV positieve controle: duidelijke versterkingscurve van FAM- en HEX-detectiekanalen, Ct-waarde≤32, maar geen versterkingscurve van CY5-kanaal;
Aan bovenstaande eisen moet tegelijkertijd in hetzelfde experiment worden voldaan;anders is het experiment ongeldig en moet het worden herhaald.
7 Bepaling van resultaten.
7.1 Als er geen amplificatiecurve of Ct-waarde> 40 is in de FAM- en HEX-kanalen van het testmonster, en er is een amplificatiecurve in het CY5-kanaal, kan worden geoordeeld dat er geen 2019 nieuw coronavirus (2019-nCoV) is RNA in het monster;
.2 Als het testmonster duidelijke amplificatiecurven heeft in de FAM- en HEX-kanalen en de Ct-waarde ≤40 is, kan worden beoordeeld dat het monster positief is voor het nieuwe coronavirus van 2019 (2019-nCoV).
7.3 Als het testmonster alleen een duidelijke versterkingscurve heeft in één kanaal van FAM of HEX, en de Ct-waarde ≤40 is, en er is geen versterkingscurve in het andere kanaal, moeten de resultaten opnieuw worden getest.Als de resultaten van de hertest consistent zijn, kan het monster als positief worden beoordeeld voor het nieuwe
coronavirus 2019 (2019-nCoV).Als het hertestresultaat negatief is, kan worden beoordeeld dat het monster negatief is voor het nieuwe coronavirus 2019 (2019-nCoV).
Positieve beoordelingswaarde
De ROC-curvemethode wordt gebruikt om de CT-referentiewaarde van de kit te bepalen en de referentiewaarde van de interne controle is 40.
Interpretatie van testresultaten
1. Elk experiment moet worden getest op negatieve en positieve controles.Testresultaten kunnen alleen worden bepaald als de controles voldoen aan de kwaliteitscontrole-eisen
2. Wanneer de FAM- en HEX-detectiekanalen positief zijn, kan het resultaat van het CY5-kanaal (intern besturingskanaal) negatief zijn als gevolg van systeemconcurrentie.
3.Als het resultaat van de interne controle negatief is en de FAM- en HEX-detectiekanalen van de reageerbuis ook negatief zijn, betekent dit dat het systeem is uitgeschakeld of dat de werking verkeerd is, en dat de test ongeldig is.Daarom moeten de monsters opnieuw worden getest.
