Producten
Lifecosm SARS-Cov-2-RT-PCR-detectiekit voor 2019-nCoV
Verwacht gebruik
Deze kit wordt gebruikt voor de kwalitatieve detectie van het nieuwe coronavirus (2019-nCoV) met behulp van keeluitstrijkjes, nasofaryngeale uitstrijkjes, bronchoalveolaire spoelvloeistof en sputum. Het detectieresultaat van dit product is alleen bedoeld voor klinische referentie en mag niet als enige worden gebruikt bewijs voor klinische diagnose en behandeling. Een uitgebreide analyse van de aandoening wordt aanbevolen in combinatie met de klinische manifestaties van de patiënt en andere laboratoriumtests.
Inspectieprincipe
De kit is gebaseerd op éénstaps RT-PCR-technologie.In feite werden de ORF1ab- en N-genen van het nieuwe coronavirus (2019-nCoV) uit 2019 geselecteerd als de doelgebieden voor amplificatie.Specifieke primers en fluorescerende probes (N-genprobes zijn gelabeld met FAM en ORF1ab-probes zijn gelabeld met HEX) zijn ontworpen om 2019 nieuw type coronavirus-RNA in monsters te detecteren.De kit bevat ook een endogeen intern controledetectiesysteem (interne controle-genprobe gelabeld met CY5) om het proces van monsterafname, RNA- en PCR-amplificatie te monitoren, waardoor fout-negatieve resultaten worden verminderd.
Hoofd onderdelen
| Componenten | Volume(48T/set） |
| RT-PCR-reactieoplossing | 96 µl |
| nCOV-primer TaqMan-probemengsel (ORF1ab, N Gene, RnaseP Gene) | 864 µl |
| Negatieve controle | 1500 µl |
| nCOV Positieve controle (l ORF1ab N-gen) | 1500 µl |
Eigen reagentia: RNA-extractie- of zuiveringsreagentia.Negatieve/positieve controle: De positieve controle is RNA dat het doelfragment bevat, terwijl de negatieve controle nucleïnezuurvrij water is.Tijdens gebruik moeten ze deelnemen aan de extractie en moeten ze als besmettelijk worden beschouwd.Ze moeten worden behandeld en verwijderd in overeenstemming met de relevante regelgeving.
Het interne referentiegen is het menselijke RnaseP-gen.
Bewaaromstandigheden en vervaldatum
-20 ± 5 ℃, vermijd herhaaldelijk invriezen en ontdooien meer dan 5 keer, geldig gedurende 6 maanden.
Toepasselijk instrument
Met FAM/HEX/CY5 en ander meerkanaals fluorescerend PCR-instrument.
Eisen aan monsters
1. Toepasselijke specimentypen: keeluitstrijkjes, nasofaryngeale uitstrijkjes, bronchoalveolaire lavagevloeistof, sputum.
2. Monstername (aseptische techniek)
Keelholteuitstrijkje: Veeg de amandelen en de achterste keelholtewand af met twee wattenstaafjes tegelijk en dompel vervolgens de kop van het wattenstaafje onder in een reageerbuisje met de monsteroplossing
Sputum: Nadat de patiënt diep heeft hoest, verzamelt u het opgehoeste sputum in een reageerbuis met schroefdop die de bemonsteringsoplossing bevat;bronchoalveolaire lavagevloeistof: bemonstering door medische professionals.3. Opslag en transport van monsters
Monsters voor virusisolatie en RNA-testen moeten zo snel mogelijk worden getest.Monsters die binnen 24 uur gedetecteerd kunnen worden, kunnen bij 4℃ worden bewaard;die niet binnen 24 kunnen worden gedetecteerd
uren moeten worden opgeslagen bij -70 ℃ of lager (als er geen opslagomstandigheden van -70 ℃ zijn, moeten ze
tijdelijk opgeslagen bij -20℃koelkast).Monsters moeten herhaaldelijk invriezen en ontdooien tijdens transport vermijden.Monsters moeten zo snel mogelijk na afname naar het laboratorium worden gestuurd.Als monsters over lange afstanden moeten worden vervoerd, wordt opslag op droogijs aanbevolen.
Testmethoden
1 Monsterverwerking en RNA-extractie (monsterverwerkingsruimte)
Het wordt aanbevolen om 200 μl vloeistofmonster te nemen voor RNA-extractie.Raadpleeg voor gerelateerde extractiestappen de instructies van commerciële RNA-extractiekits.Zowel het negatieve als het negatieve
controles in deze kit waren betrokken bij de extractie.
2 PCR-reagensvoorbereiding (reagensvoorbereidingsgebied)
2.1 Verwijder alle componenten uit de set, ontdooi en meng bij kamertemperatuur.Centrifugeer vóór gebruik enkele seconden bij 8.000 tpm;bereken de vereiste hoeveelheid reagentia en het reactiesysteem wordt bereid zoals weergegeven in de volgende tabel:
| Componenten | N portie (25 µl systeem) |
| nCOV-primer TaqMan-sondemengsel | 18 µl × N |
| RT-PCR-reactieoplossing | 2 µl × N |
| *N = aantal geteste monsters + 1 (negatieve controle) + 1 (nCOVpositieve controle) | |
2.2 Nadat u de componenten grondig hebt gemengd, centrifugeert u een korte tijd zodat alle vloeistof op de buiswand naar de bodem van de buis valt en verdeelt u vervolgens het amplificatiesysteem van 20 µl in de PCR-buis.
3 Bemonstering (monstervoorbereidingsruimte)
Voeg na extractie 5 μl van de negatieve en positieve controles toe.Het RNA van het te testen monster wordt aan de PCR-reactiebuis toegevoegd.
Sluit het buisje goed af en centrifugeer een paar seconden bij 8.000 rpm voordat u het naar het amplificatiedetectiegebied brengt.
4 PCR-amplificatie (versterkt detectiegebied)
4.1 Plaats de reactiebuis in de monstercel van het instrument en stel de parameters als volgt in:
| fase | Fiets nummer | Temperatuur(°C) | Tijd | verzamelingplaats |
| Achteruittranscriptie | 1 | 42 | 10 minuten | - |
| Pre-denaturatien | 1 | 95 | 1 minuut | - |
| Fiets | 45 | 95 | 15s | - |
| 60 | Jaren '30 | gegevensverzameling |
Selectie van instrumentdetectiekanaal: Selecteer het FAM、HEX、CY5-kanaal voor het fluorescentiesignaal.Als referentie fluorescerend GEEN, kies dan niet ROX.
5 Resultaatanalyse (raadpleeg de experimentele instructies van elk instrument voor instelling)
Sla na de reactie de resultaten op.Pas na analyse de startwaarde, eindwaarde en drempelwaarde van de basislijn aan volgens de afbeelding (de gebruiker kan aanpassen aan de werkelijke situatie, de startwaarde kan worden ingesteld op 3 ~ 15, de eindwaarde kan worden ingesteld op 5~20, aanpassing) in de logaritmische grafiek. Bij de drempel van het venster bevindt de drempellijn zich in de logaritmische fase en is de versterkingscurve van de negatieve controle een rechte lijn of onder de drempellijn).
6 Quauty-controle (een procedurele controle is inbegrepen in de test) Negatieve controle: geen duidelijke amplificatiecurve voor FAM-, HEX-, CY5-detectiekanalen
COV-positieve controle: duidelijke amplificatiecurve van FAM- en HEX-detectiekanalen, Ct-waarde≤32, maar geen amplificatiecurve van CY5-kanaal;
In hetzelfde experiment moet tegelijkertijd aan de bovenstaande vereisten worden voldaan;anders is het experiment ongeldig en moet het worden herhaald.
7 Bepaling van resultaten.
7.1 Indien er geen amplificatiecurve of Ct-waarde > 40 aanwezig is in de FAM- en HEX-kanalen van het testmonster, en wel een amplificatiecurve in het CY5-kanaal, kan worden geoordeeld dat er geen sprake is van 2019 nieuw coronavirus (2019-nCoV) RNA in het monster;
.2 Als het testmonster duidelijke amplificatiecurves heeft in de FAM- en HEX-kanalen en de Ct-waarde ≤40 is, kan worden geoordeeld dat het monster positief is voor het nieuwe coronavirus 2019 (2019-nCoV).
7.3 Als het testmonster slechts in één kanaal van FAM of HEX een duidelijke amplificatiecurve heeft, en de Ct-waarde ≤40 is, en er geen amplificatiecurve in het andere kanaal is, moeten de resultaten opnieuw worden getest.Als de hertestresultaten consistent zijn, kan het monster als positief worden beoordeeld voor het nieuwe monster
coronavirus 2019 (2019-nCoV).Als het hertestresultaat negatief is, kan worden geoordeeld dat het monster negatief is voor het nieuwe coronavirus 2019 (2019-nCoV).
Positieve beoordelingswaarde
De ROC-curvemethode wordt gebruikt om de CT-referentiewaarde van de kit te bepalen en de referentiewaarde voor de interne controle is 40.
Interpretatie van testresultaten
1.Elk experiment moet worden getest op negatieve en positieve controles.Testresultaten kunnen alleen worden bepaald als de controles voldoen aan de eisen van de kwaliteitscontrole
2. Wanneer de FAM- en HEX-detectiekanalen positief zijn, kan het resultaat van het CY5-kanaal (intern controlekanaal) negatief zijn vanwege systeemconcurrentie.
3. Als het resultaat van de interne controle negatief is en de FAM- en HEX-detectiekanalen van de reageerbuis ook negatief zijn, betekent dit dat het systeem is uitgeschakeld of dat de werking verkeerd is, en dat de test ongeldig is.Daarom moeten de monsters opnieuw worden getest.
