Producten
Lifecosm SARS-Cov-2-RT-PCR-detectiekit voor 2019-nCoV
Verwacht gebruik
Deze kit wordt gebruikt voor de kwalitatieve detectie van het nieuwe coronavirus (2019-nCoV) met behulp van keeluitstrijkjes, neus-keelholteuitstrijkjes, bronchoalveolaire lavagevloeistof en sputum. De detectie-uitslag van dit product is alleen bedoeld voor klinische referentie en mag niet worden gebruikt als het enige bewijs voor klinische diagnose en behandeling. Een uitgebreide analyse van de aandoening wordt aanbevolen in combinatie met de klinische verschijnselen van de patiënt en andere laboratoriumtests.
Inspectieprincipe
De kit is gebaseerd op one-step RT-PCR-technologie. De ORF1ab- en N-genen van het nieuwe coronavirus 2019 (2019-nCoV) werden geselecteerd als doelregio's voor de amplificatie. Specifieke primers en fluorescerende probes (N-genprobes zijn gelabeld met FAM en ORF1ab-probes met HEX) zijn ontworpen om RNA van het nieuwe coronavirus 2019 in monsters te detecteren. De kit bevat ook een endogeen intern controledetectiesysteem (interne controlegenprobe gelabeld met CY5) om het proces van monsterafname, RNA- en PCR-amplificatie te monitoren en zo vals-negatieve resultaten te verminderen.
Hoofdcomponenten
| Componenten | Volume(48T/Kit） |
| RT-PCR-reactieoplossing | 96µl |
| nCOV-primer TaqMan-probemengsel (ORF1ab, N Gene, RnaseP Gene) | 864µl |
| Negatieve controle | 1500µl |
| nCOV Positieve controle (l ORF1ab N-gen) | 1500µl |
Eigen reagentia: RNA-extractie- of zuiveringsreagentia. Negatieve/positieve controle: De positieve controle is RNA dat het doelfragment bevat, terwijl de negatieve controle nucleïnezuurvrij water is. Tijdens gebruik dienen deze reagentia deel te nemen aan de extractie en moeten ze als infectieus worden beschouwd. Ze dienen te worden behandeld en afgevoerd volgens de relevante regelgeving.
Het interne referentiegen is het menselijke RNaseP-gen.
Bewaarcondities en houdbaarheidsdatum
-20±5℃, vermijd herhaaldelijk invriezen en ontdooien meer dan 5 keer, geldig gedurende 6 maanden.
Toepasselijk instrument
Met FAM / HEX / CY5 en andere multikanaals fluorescerende PCR-instrumenten.
Specimenvereisten
1. Toepasselijke soorten monsters: keeluitstrijkjes, neus-keeluitstrijkjes, bronchoalveolaire lavagevloeistof, sputum.
2. Monsterafname (aseptische techniek)
Faryngeale swab: Veeg de amandelen en de achterste faryngeale wand af met twee swabs tegelijk en dompel vervolgens de swabkop onder in een reageerbuis met de monsteroplossing
Sputum: Nadat de patiënt een diepe hoest heeft gehad, wordt het opgehoeste sputum verzameld in een reageerbuis met schroefdop die de monsteroplossing bevat; bronchoalveolaire lavagevloeistof: monsterafname door medisch personeel. 3. Bewaring en transport van monsters
Monsters voor virusisolatie en RNA-testen moeten zo snel mogelijk worden getest. Monsters die binnen 24 uur detecteerbaar zijn, kunnen bij 4 °C worden bewaard; monsters die niet binnen 24 uur kunnen worden gedetecteerd, moeten bij 4 °C worden bewaard.
uren moeten worden bewaard bij -70℃ of lager (als er geen opslagconditie van -70℃ is, moeten ze
Tijdelijk bewaren bij een koelkast van -20 °C). Monsters moeten herhaaldelijk invriezen en ontdooien tijdens transport vermijden. Monsters moeten zo snel mogelijk na afname naar het laboratorium worden gestuurd. Als monsters over lange afstanden moeten worden vervoerd, wordt opslag op droogijs aanbevolen.
Testmethoden
1 Monsterverwerking en RNA-extractie (monsterverwerkingsgebied)
Het wordt aanbevolen om 200 μl vloeistofmonster te nemen voor RNA-extractie. Raadpleeg voor gerelateerde extractiestappen de instructies van commerciële RNA-extractiekits. Zowel de negatieve als de negatieve
De controles in deze kit waren betrokken bij de extractie.
2 PCR-reagensbereiding (reagensbereidingsgebied)
2.1 Haal alle componenten uit de kit, ontdooi ze en meng ze bij kamertemperatuur. Centrifugeer enkele seconden op 8000 tpm vóór gebruik; bereken de benodigde hoeveelheid reagentia en bereid het reactiesysteem voor zoals weergegeven in de volgende tabel:
| Componenten | N-portie (25µl-systeem) |
| nCOV-primer TaqMan-sondemengsel | 18 µl × N |
| RT-PCR-reactieoplossing | 2 µl × N |
| *N = aantal geteste monsters + 1 (negatieve controle) + 1 (nCOVpositieve controle) | |
2.2 Nadat u de componenten grondig hebt gemengd, centrifugeert u het mengsel kort, zodat alle vloeistof op de buiswand naar de bodem van de buis zakt. Giet vervolgens het 20 µl amplificatiesysteem in de PCR-buis.
3 Bemonstering (monstervoorbereidingsgebied)
Voeg na extractie 5 μl van de negatieve en positieve controles toe. Het RNA van het te testen monster wordt toegevoegd aan de PCR-reageerbuis.
Sluit het buisje goed af en centrifugeer het enkele seconden op 8.000 toeren per minuut voordat u het overbrengt naar de detectieruimte voor amplificatie.
4 PCR-amplificatie (versterkt detectiegebied)
4.1 Plaats de reactiebuis in de monstercel van het instrument en stel de parameters als volgt in:
| fase | Cyclus nummer | Temperatuur(°C) | Tijd | verzamelingsite |
| Achteruittranscriptie | 1 | 42 | 10 minuten | - |
| Pre-denaturatien | 1 | 95 | 1 minuut | - |
| Cyclus | 45 | 95 | 15s | - |
| 60 | jaren 30 | gegevensverzameling |
Kanaalselectie instrumentdetectie: Selecteer het FAM-, HEX- en CY5-kanaal voor het fluorescentiesignaal. Kies voor fluorescentiesignaal NONE als referentie, maar kies niet ROX.
5 Resultaatanalyse (Raadpleeg de experimentele instructies van elk instrument voor de instellingen)
Sla de resultaten na de reactie op. Pas na de analyse de startwaarde, eindwaarde en drempelwaarde van de basislijn aan op basis van de afbeelding (de gebruiker kan deze aanpassen aan de werkelijke situatie; de startwaarde kan worden ingesteld op 3 tot 15, de eindwaarde kan worden ingesteld op 5 tot 20, aanpassing) in de logaritmische grafiek. Bij de drempelwaarde van het venster bevindt de drempellijn zich in de logaritmische fase en is de versterkingscurve van de negatieve controle een rechte lijn (of lager dan de drempellijn).
6 Kwaliteitscontrole (een procedurele controle is opgenomen in de test) Negatieve controle: geen duidelijke versterkingscurve voor FAM-, HEX- en CY5-detectiekanalen
COV-positieve controle: duidelijke amplificatiecurve van FAM- en HEX-detectiekanalen, Ct-waarde ≤ 32, maar geen amplificatiecurve van CY5-kanaal;
Aan de bovenstaande vereisten moet gelijktijdig in hetzelfde experiment worden voldaan. Anders is het experiment ongeldig en moet het worden herhaald.
7 Vaststelling van de resultaten.
7.1 Indien er geen amplificatiecurve of Ct-waarde > 40 is in de FAM- en HEX-kanalen van het testmonster, en er is een amplificatiecurve in het CY5-kanaal, kan worden geoordeeld dat er geen RNA van het nieuwe coronavirus 2019 (2019-nCoV) in het monster aanwezig is;
.2 Als het testmonster duidelijke amplificatiecurven heeft in de FAM- en HEX-kanalen en de Ct-waarde ≤40 is, kan worden geoordeeld dat het monster positief is voor het nieuwe coronavirus uit 2019 (2019-nCoV).
7.3 Als het testmonster slechts in één kanaal van FAM of HEX een duidelijke amplificatiecurve heeft, de Ct-waarde ≤ 40 is en er geen amplificatiecurve is in het andere kanaal, moeten de resultaten opnieuw worden getest. Als de resultaten van de hertest consistent zijn, kan het monster als positief worden beoordeeld voor de nieuwe test.
coronavirus 2019 (2019-nCoV). Als de hertestuitslag negatief is, kan worden geoordeeld dat het monster negatief is voor het nieuwe coronavirus 2019 (2019-nCoV).
Positieve oordeelswaarde
De ROC-curvemethode wordt gebruikt om de referentie-CT-waarde van de kit te bepalen en de interne controlereferentiewaarde is 40.
Interpretatie van testresultaten
1. Elk experiment moet worden getest op negatieve en positieve controles. Testresultaten kunnen alleen worden bepaald als de controles voldoen aan de kwaliteitscontrole-eisen.
2. Wanneer de FAM- en HEX-detectiekanalen positief zijn, kan het resultaat van het CY5-kanaal (interne controlekanaal) negatief zijn vanwege systeemconcurrentie.
3. Als het resultaat van de interne controle negatief is, en de FAM- en HEX-detectiekanalen van de reageerbuis ook negatief zijn, betekent dit dat het systeem is uitgeschakeld of dat de werking onjuist is. De test is dan ongeldig. De monsters moeten daarom opnieuw worden getest.
